Полное собрание законодательства СССР
Система доступа к базе всех нормативно-правовых актов Союза Советских Социалистицеских Республик.
www.ussrdoc.com

 





Сборники документов по хронологии с 1917г по 1992г
| Сборник 1 | Сборник 2 | Сборник 3 | Сборник 4 | Сборник 5 | Сборник 6 | Сборник 7 | Сборник 8 | Сборник 9 | Сборник 10 |



 

Утверждены

Министерством

здравоохранения РСФСР

 

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СЫПНОГО ТИФА

 

(МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ)

 

Методические указания об иммунологических способах диагностики риккетсиозов, составленные К.Н. Токаревичем и Л.Д. Васильевой, были изданы институтом в 1960 и 1961 годах. С тех пор накоплен большой дополнительный материал, характеризующийся введением в практику все более чувствительных и специфических методик.

В связи с эпидемиологическим и клиническим своеобразием спорадических случаев сыпного тифа (болезни Брилля-Цинссера) современные лабораторные методы диагностики этой инфекции приобрели особенно важное значение. Они позволяют не только надежно подтверждать сыпнотифозную природу заболеваний, но и решать важные вопросы эпидемиологического характера, например, выявление источника инфекции, обнаружение зараженных переносчиков, дифференцирование эпидемического (передающегося через вшей) и спорадического (рецидивного) сыпного тифа, определение иммунной прослойки к сыпному тифу среди населения и т.д. Этим способам и посвящено настоящее издание.

 

I. ВЫДЕЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЫПНОГО ТИФА ОТ БОЛЬНЫХ

 

Возбудитель сыпного тифа - риккетсии Провачека может быть обнаружен в крови заболевшего в последние дни инкубации, в продроме и в течение всего лихорадочного периода; риккетсии исчезают из крови после падения температуры, в первые дни реконвалесценции, когда в крови больного специфические антитела достигают высокой концентрации. Наибольшее количество риккетсий циркулирует в крови в первые дни лихорадки и поэтому ранние сроки заболевания особенно перспективны для выделения возбудителя.

Риккетсии Провачека - облигатные внутриклеточные паразиты; они не растут на обычных питательных средах и могут размножаться лишь в живых или переживающих клетках. Выделение возбудителя из крови больного производят путем заражения восприимчивых лабораторных животных, обычно морских свинок, или при помощи инфицирования вшей, выращенных в лаборатории.

 

а) Выделение возбудителя при помощи

биологической пробы на морских свинках

 

Морским свинкам весом 250 граммов, которым предварительно в течение нескольких дней проверяют температуру, вводят внутрибрюшинно дефибринированную кровь больного в объеме 3 - 5 мл или взвесь в физиологическом растворе сгустка свернувшейся крови в том же объеме. (Сыворотка, отделенная от сгустка, может быть использована для иммунологического исследования.)

При наличии риккетсии Провачека в исследуемой крови подопытные морские свинки начинают лихорадить спустя примерно 5 - 15 дней и при этом теряют в весе. Лихорадочное состояние животных, хорошо воспроизводимое в цепи пассажей, продолжается от 2 - 3 до 8 - 10 дней. Ежедневное термометрирование свинок проводится ректально специальным термометром в течение 30 дней.

Длительность инкубации и лихорадочного периода, а также высота лихорадки зависят в основном от концентрации возбудителя в исследуемой крови больного.

Для подтверждения сыпнотифозной природы лихорадки у животного, после падения температуры, через 3 - 4 недели после заражения, морских свинок исследуют серологически. Наличие комплементфиксирующих антител или агглютининов к риккетсиям Провачека убеждает в специфичности заболевания. Риккетсиальная этиология перенесенной экспериментальной инфекции может быть подтверждена также испытанием иммунности свинок путем заражения их риккетсиями Провачека спустя полтора-два месяца после прекращения лихорадки.

Поддержание возбудителя на животных производится путем пассажей мозговой тканью. С этой целью морскую свинку забивают на высоте лихорадки, из черепной коробки стерильно извлекают мозг и подвергают его гомогенизации в физиологическом растворе (обычно в банке со стеклянными бусами). Введение внутрибрюшинно 1 - 2 мл 10-процентной мозговой взвеси здоровым животным воспроизводит лихорадку у последних.

При экспериментальной сыпнотифозной инфекции возбудитель визуально не обнаруживается в мазках-отпечатках из органов морских свинок. Только при внутрибрюшинном введении им концентрированных взвесей риккетсий Провачека (например, из инфицированных вшей или легких интраназально зараженных мышей) удается вызвать у животных перитонеальный риккетсиоз, а у самцов периорхит. В этих случаях в мазках-отпечатках из туника вагиналис или из соскоба с брюшины удается обнаружить возбудителя. Для сохранения и выделения риккетсий в визуальной форме мозговой взвесью лихорадящей морской свинки заражают куриные эмбрионы, белых мышей (интраназально), поддерживаемых в лаборатории вшей или культуру ткани.

 

б) Выделение риккетсий Провачека путем заражения переносчика

 

Платяная вошь является переносчиком риккетсий Провачека. Возбудитель сыпного тифа вызывает заболевание этих насекомых, заканчивающееся их гибелью. Вошь, напитавшаяся кровью сыпнотифозного больного в период риккетсиемии, уже в первые дни становится заразной. На второй-третий день после заражения при помощи иммунлюминесцентного метода (см. ниже) удается уже обнаружить в мазках из кишечников вшей единичные риккетсии. В дальнейшем наблюдается интенсивное размножение этих микроорганизмов, причем на 5 - 6 день после кровососания риккетсии в кишечнике обнаруживаются в больших количествах. Максимальное накопление их наблюдается на 8 - 10 день. Размножение возбудителя в эпителиальных клетках кишечника насекомых приводит к разрушению инфицированных клеток, что вызывает нарушение процесса пищеварения. Нередко за 1 - 2 дня до гибели вошь приобретает красный цвет вследствие проникновения крови через разрушенные клетки кишечника в полость тела. В мазках-отпечатках из кишечников больных вшей при окраске по Романовскому-Гимза или по Здродовскому обнаруживается огромное количество риккетсий Провачека в виде полиморфных, главным образом палочковидных образований. Быстрота развития риккетсиоза у вшей, так же как и гибель насекомых, зависят от интенсивности риккетсиемии у больных людей. Выделение возбудителя из крови больного может быть проведено путем непосредственного кормления лабораторных насекомых на больном.

При необходимости исследования вшей, снятых с больного или собранных в его окружении, выделение возбудителя может быть проведено двумя способами: внутрибрюшинным заражением морских свинок взвесью растертых насекомых или заражением этой же взвесью лабораторных ("паспортных") вшей. Последнее осуществляется при помощи вскармливания однодневных личинок вшей через эпидермомембрану по Пшеничнову или же по методу Вейгля (при помощи микроклизм). В дальнейшем наблюдение за насекомыми проводят при помощи микроскопии окрашенных препаратов из кишечника последних.

Приведенное краткое описание приемов выделения культуры риккетсий Провачека из крови больных показывает сложность применяемых для этого методик, которые могут быть осуществлены только в обстановке специальных лабораторий.

Метод биопроб на морских свинках довольно широко применялся для выявления возбудителя в начале изучения сыпного тифа в эпоху эпидемического его распространения при классических формах этой инфекции. При заражении животных кровью таких больных на ранних днях болезни удавалось весьма часто воспроизводить экспериментальную инфекцию у морских свинок. При спорадическом же сыпном тифе (болезни Брилля) биологические пробы на морских свинках в очень редких случаях бывают положительными.

Более эффективным методом является вскармливание переносчика на больном в первые дни лихорадки. Однако и при этом способе у больных болезнью Брилля удается обнаружить риккетсии только при тяжелых формах заболеваний. При этом вследствие низкой концентрации риккетсий в крови больных в большинстве случаев при болезни Брилля удается обнаруживать их во вшах лишь после пассажа через эпидермомембрану.

Культивирование риккетсий Провачека в лабораториях необходимо для приготовления диагностикумов и вакцин, а попытки выделения новых штаммов не потеряли своего значения и в настоящее время для изучения их биологических особенностей.

 

II. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СЫПНОГО ТИФА

 

Из иммунологических способов диагностики риккетсиозов в настоящее время ведущее место занимают серологические.

При сыпном тифе серологический анализ используют как для распознавания заболеваний, так и для решения эпидемиологических вопросов, связанных с данной инфекцией.

Основным методом серодиагностики сыпного тифа является реакция связывания комплемента, которая характеризуется высокой специфичностью. Используют также реакцию агглютинации риккетсий и реакцию непрямой гемагглютинации. Постановка этих серологических проб предусмотрена отечественными официальными инструкциями. Они должны применяться в лабораториях инфекционных больниц и санэпидстанций. Согласно утвержденным Минздравом СССР Инструктивно-методическим указаниям (N 310 от 23.04.1968) с целью наиболее полного выявления больных сыпным тифом серологическому обследованию должны подвергаться:

лица, лихорадящие в течение 5 дней и более с диагнозами, не позволяющими полностью отвергнуть сыпной тиф;

провизорно госпитализированные с подозрением на сыпной тиф;

лица, бывшие в контакте с заболевшими сыпным тифом, в том числе:

а) при отсутствии у них педикулеза - перенесшие в течение последних 3-х месяцев какое-либо лихорадочное заболевание;

б) при наличии педикулеза - все находившиеся в контакте с больными сыпным тифом.

У сыпнотифозных больных, не леченных антибиотиками, специфические антитела в крови могут быть обнаружены в невысоких титрах начиная с 5 - 7 дня болезни; к 10 дню они могут быть выявлены почти у всех больных, причем титры антител достигают наивысшего уровня к 15 - 20 дню от начала лихорадки, после чего постепенно снижаются. При получении негативного ответа или положительной реакции в низких титрах при первом обследовании серологическое исследование необходимо повторить через 3 - 5 дней.

Кроме перечисленных серологических реакций, для серодиагностики сыпного тифа используют иммунлюминесцентный метод исследования, а также реакцию преципитации. Весьма чувствительной пробой является реакция нейтрализации токсической субстанции риккетсий, позволяющая выявлять наличие в крови больных и болевших вируснейтрализующих антител. Эта реакция может быть применена лишь в специализированных лабораториях, т.к. она ставится с живыми риккетсиями, содержащими токсическое вещество.

Для серологических исследований кровь берут в стерильную пробирку из локтевой вены в количестве 3 - 5 мл. Ее свертывают в термостате при 37° в течение 15 - 30 минут, а для отстаивания сыворотки пробирку помещают в комнатный холодильник. В тех случаях, когда взять кровь из вены не удается (например, у детей), кровь берут из пальца.

Кончик пальца протирают спиртом и прокалывают иглой, кровь набирают микропипеткой 0,2 мл и вносят в пробирку с 1,8 мл стерильного физиологического раствора, содержащего 0,25% лимоннокислого натрия, что соответствует разведению сыворотки 1:10. Для осаждения форменных элементов взвесь центрифугируют при 1 - 2 тысячах об./мин. в течение 5 - 10 минут или оставляют в рефрижераторе до следующего дня.

При невозможности проведения исследований на месте сыворотки пересылают в лабораторию в запаянных ампулах.

Сыворотки могут быть доставлены также и в высушенном виде на фильтровальной бумаге или на стекле. В первом случае 0,2 - 0,4 мл прозрачной (не содержащей эритроцитов) сыворотки наносят градуированной пипеткой на фильтровальную бумагу и высушивают при комнатной температуре. В лаборатории участок бумаги с нанесенной сывороткой вырезают, измельчают ножницами и помещают в пробирку с физиологическим раствором, взятым в таком объеме, чтобы получить исходное разведение сыворотки 1:10. В термостате при 37° в течение часа происходит полное растворение сыворотки; ее отсасывают и используют для постановки реакции по обычной методике.

Высушивание на стекле проводят в соответствии с инструкцией Министерства здравоохранения СССР, предложенной для серодиагностики сифилиса: на тщательно вымытое предметное стекло наносят 0,2 мл сыворотки, которая свободно растекается по поверхности при покачивании стекла. Последнее накрывают чашкой Петри и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Высохшую сыворотку соскабливают и помещают в пакетик. В день постановки реакции содержимое пакетика высыпают в пробирку и заливают 1,8 мл физиологического раствора, что создает разведение 1:10. Пробирки ставят на час в термостат, после чего сыворотку инактивируют и готовят необходимые разведения.

Примечание. С этими сыворотками можно ставить реакции связывания комплемента и гемагглютинации, но они непригодны для постановки реакции агглютинации.

 

Каждую пробу сыворотки должны сопровождать следующие данные о больном: фамилия, имя, возраст, профессия (место работы), день болезни, дата взятия крови, предполагаемый диагноз, анамнез в отношении перенесения сыпного тифа в прошлом.

 

1. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

С АНТИГЕНАМИ ИЗ РИККЕТСИЙ ПРОВАЧЕКА

 

Широкое применение серологических методов исследования со специфическими антигенами из риккетсий Провачека стало возможным благодаря разработке способов культивирования и накопления риккетсий.

Достоверность серологических методов исследования при риккетсиозах определяется качеством выпускаемых централизованно риккетсиальных антигенов. Они представляют собой очищенные и стандартизированные взвеси риккетсий Провачека, выращенных в желточных оболочках куриных эмбрионов по Коксу или культивируемых во вшах.

Риккетсиальные антигены, применяемые в серологических реакциях, выпускают в виде корпускулярных взвесей, растворимых субстанций, или цельных антигенов, состоящих из корпускул риккетсий и растворимых фракций.

Корпускулярные антигены применяют для реакции агглютинации, цельные же и растворимые - для реакции связывания комплемента, а также для реакции преципитации.

Ввиду малой стойкости жидких антигенов (лизис и аггрегация риккетсий) в настоящее время их выпускают в сухом виде в запаянных ампулах, что обеспечивает неизменность их свойств на протяжении длительного времени при хранении при +4 - +10 °С.

В день постановки реакции антигены разводят физиологическим раствором согласно указаниям на этикетке ампул или в прилагаемом к препарату наставлении.

Сухие антигены, подвергнутые лиофильному высушиванию, должны иметь вид сухого порошка, хорошо отстающего от стенок ампул, или сухой пористой массы. Если содержимое ампулы плохо растворяется и выпадает в виде хлопьев, это указывает на недоброкачественность антигена (дефекты высушивания или нарушение вакуума).

Срок годности диагностикума указывается на этикетке ампул: по прошествии его антигены подлежат обязательной проверке с 2 - 3 заведомо положительными сыворотками средних титров и с 2 - 3 отрицательными сыворотками.

Каждая вновь полученная серия антигена перед введением ее в опыт также должна быть проверена с заведомо положительными и отрицательными инфекционными или иммунсыворотками.

 

а) Реакция связывания комплемента (РСК)

 

Реакция связывания комплемента имеет целью определение в исследуемых сыворотках специфических комплементсвязывающих антител.

Сущность реакции заключается в связывании комплемента специфически комплексом (антиген + антитело), что обнаруживается в присутствии индикатора: бараньих эритроцитов, сенсибилизированных гемолитической сывороткой. При образовании комплекса антиген + антитело последний связывает комплемент и вследствие этого после добавления гемолитической системы не возникает гемолиза. Если же комплекс антиген + антитело не образуется, свободный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов.

Таким образом, положительный результат РСК характеризуется отсутствием или задержкой гемолиза, а отрицательный - феноменом гемолиза (рис. 1 - здесь и далее рисунки не приводятся).

Реакцию связывания комплемента можно ставить при 37° и путем длительного связывания на холоде (при +4°). Последний способ чувствительнее первого, но требует несколько большего срока для завершения исследования (около суток); поэтому для диагностических целей обычно применяют метод постановки РСК в условиях термостата, что позволяет закончить исследование в течение одного дня.

Для постановки РСК необходимо 5 ингредиентов: 1) испытуемая сыворотка; 2) антиген; 3) комплемент; 4) гемолитическая сыворотка; 5) эритроциты барана. Реакцию ставят в общем объеме 1 мл, т.е. берут по 0,2 каждого ингредиента. Обязательным условием постановки РСК является использование точно оттитрованных компонентов.

Для обеспечения точности получаемых результатов необходимо пользоваться отдельной посудой (пробирки, пипетки, колбы), хорошо вымытой и высушенной в сухожаровом шкафу.

Для каждого ингредиента реакции используют отдельную пипетку. Все разведения делают стерильным физиологическим раствором (0,85-процентный раствор химически чистой поваренной соли в дистиллированной воде).

Исследуемую сыворотку прогревают перед опытом в течение 30 минут при 56 - 58° для разрушения комплемента.

Риккетсиальный антиген и гемолитическую сыворотку титруют те институты, которые их готовят. В соответствии с данными титрования на этикетке сухого антигена указывают объем жидкости, в котором он должен быть растворен, а на этикетке гемолитической сыворотки указывают ее титр.

Комплемент употребляют или сухой (выпускаемый в ампулах), или жидкий. Для получения последнего берут по 2 - 3 мл крови из сердца нескольких морских свинок в стерильную посуду и после отстаивания сыворотки ее разливают в пробирки и хранят в леднике (при +4°). Комплемент консервируют химическими смесями, например, 0,05 г сернокислого натрия и 0,04 г кристаллической борной кислоты на 1 мл сыворотки (Гинзбург, Калинин, 1947), или замораживанием в рефрижераторе при температуре минус 20°. Сухой комплемент применяется согласно прилагаемой к этому препарату инструкции. Как свежий, так и консервированный комплемент следует титровать каждый раз перед постановкой опыта.

При работе с риккетсиальными антигенами основным разведением комплемента является обычно 1:10.

Гемолитическая сыворотка выпускается в ампулах; это сыворотка кролика, иммунизированного по определенной схеме взвесью бараньих эритроцитов. В опыт гемолитическую сыворотку вводят в тройном титре: например, рабочий титр, указанный на этикетке, равен 1:1800; в этом случае в опыт берут сыворотку, разведенную 1:600. При длительном хранении первоначальный титр гемолитической сыворотки может снижаться. Проверку ее титра производят следующим образом. Готовят основное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки + 9,9 мл физиологического раствора). В ряд пробирок последовательно разливают по 0,2 мл разведений сывороток, начиная с 1:1000; в каждую пробирку добавляют комплемент в разведении 1:10 в объеме 0,2 мл и по 0,2 мл 3-процентной взвеси бараньих эритроцитов; затем доливают в каждую пробирку по 0,4 мл физиологического раствора. Смесь ингредиентов выдерживают в термостате при 37° в течение часа. По наличию полного гемолиза эритроцитов судят о титре сыворотки. Схема титрования гемолитической сыворотки представлена в таблице 1.

 

Таблица 1

 

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ

 

┌───────────────┬──────┬──────┬──────┬──────┬──────┬──────┬──────┬──────┬──────┬──────┐

│\Разведения    │1:1000│1:1200│1:1600│1:2000│1:2400│1:2800│1:3000│1:3200│1:3600│1:4000│

  \гемолитичес-│                                                           

    \кой сыво- │                                                           

│Ингре-\ротки                                                              

│диенты  \                                                                 

│опыта     \                                                               

├───────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┤

│Гемолитическая │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2  

│сыворотка                                                                 

├───────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┤

│3-процентная   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2  

│взвесь бараньих                                                           

│эритроцитов                                                               

├───────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┤

│Комплемент в   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2   │0,2  

разведении 1:10│                                                           

├───────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┤

│Физиологический│0,4   │0,4   │0,4   │0,4   │0,4   │0,4   │0,4   │0,4   │0,4   │0,4  

│раствор                                                                   

├───────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┤

│Оценка резуль- │-     │-     │-     │-     │++    │++++  │++++  │++++  │++++  │++++ 

│татов опыта                                                               

├───────────────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┤

                   Титр гемолитической сыворотки 1:2000                              

└─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

Бараньи эритроциты. Кровь, взятую из яремной вены барана, дефибринируют в банке с бусами, процеживают через стерильную марлю и хранят в леднике. Перед опытом дефибринированную кровь отмывают при помощи центрифугирования трижды физиологическим раствором (до исчезновения следов гемолиза) и готовят 3-процентную взвесь эритроцитов. Ввиду малой устойчивости эритроцитов они могут сохраняться в условиях ледника без изменения только в течение 3 - 5 дней. В связи с этим предложены следующие методы их консервирования.

1) К 100 мл дефибринированной крови барана добавляют 15 мл раствора, состоящего из физиологического раствора 100 мл, борной кислоты 4 г и глюкозы 6 г. Раствор кипятят в водяной банке по 20 минут 3 дня подряд. Консервированные указанным способом эритроциты могут сохраняться в рефрижераторе 3 - 4 месяца (Е.М. Голиневич).

2) Консервирование эритроцитов проводят также путем непосредственного соединения взятой от барана крови с консервантом, приготовленным по прописи Алсвера: хлористый натр 4,2 г, глюкоза 20,5 г, лимоннокислый натр 8 г, дистиллированная вода 1000 мл. pH раствора должен быть 6,2. Раствор стерилизуют текучим паром или кипятят в водяной бане по 30 минут 3 дня подряд. Кровь от барана берут в стерильные флаконы, в которые предварительно наливают равный объем этого консерванта.

Консервированные эритроциты в день постановки опыта трехкратно отмывают физиологическим раствором, как указано выше.

 

ПОРЯДОК ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

 

Накануне постановки основного опыта РСК проводят следующую подготовительную работу:

1. Отсос от сгустков крови исследуемых сывороток и инактивирование их при 56° в течение 30 минут.

2. Взятие крови у свинок для получения комплемента.

3. Взятие крови у барана.

В день постановки опыта производят:

1. Отмывание бараньих эритроцитов.

2. Титрование комплемента.

 

ТИТРОВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА

 

Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента с целью определения его рабочей дозы.

Титрование начинают с приготовления гемолитической системы, которая состоит из равных объемов 3-процентной взвеси отмытых эритроцитов барана и гемолитической сыворотки в разведении, соответствующем тройному ее титру. После тщательного смешивания эритроцитов с гемолитической сывороткой смесь (гемосистему) ставят в термостат при 37° на 30 минут.

На протяжении этого времени готовят разведения комплемента, начиная с исходного 1:10. В ряд пробирок разливают микропипеткой различные дозы разведенного комплемента с интервалом 0,01 мл. Так как титрование комплемента ведется в отсутствии антигена, то объем жидкости в каждой пробирке доводится до 0,6 мл физиологическим раствором, а затем добавляют по 0,4 мл гемолитической системы, выдержанной в термостате 30 минут. Пробирки тщательно встряхивают и ставят в термостат на 30 минут, после чего немедленно учитывают результат (табл. 2).

 

Таблица 2

 

ПРИМЕР ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

 

N пробирки             

1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  

8  

9  

10

Комплемент в разведении
1:10                   

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

Физиологический раствор

0,59

0,58

0,57

0,56

0,55

0,54

0,53

0,52

0,51

0,5

Гемолитическая система 

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

Оценка результата      

4+ 

3+ 

2+ 

1+ 

-  

-  

-  

-  

-  

- 

 

Оценка результатов титрования комплемента заключается в определении степени задержки гемолиза: отсутствие гемолиза (полная его задержка) обозначается четырьмя крестами; почти полная задержка (следы гемолиза) обозначаются тремя крестами; частичная задержка гемолиза оценивается двумя крестами и, наконец, следы задержки (почти полный гемолиз) - одним крестом.

Единицей комплемента считают то наименьшее его количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере эта единица соответствует 0,05 разведения комплемента 1:10. За полную единицу комплемента принимают вторую пробирку полного гемолиза, в данном примере 0,06 мл. Под рабочей дозой комплемента понимают количество его, содержащееся во второй пробирке с полным гемолизом, т.е. одна полная единица комплемента при проведении связывания в термостате при 37° в течение часа или две полные единицы при холодном связывании (в рефрижераторе при +4 °С в течение 18 часов). В приведенном примере титрования комплемента рабочая доза при горячем способе связывания равна 0,06 на каждую пробирку, при холодном 0,06 х 2 = 0,12.

Титрование комплемента можно производить и без применения микропипетки. В этом случае разведения комплемента предварительно приготавливают в отдельном штативе. В ряд пробирок разливают однокубиковой пипеткой нарастающие дозы комплемента (разведенного 1:10), начиная с 0,1 до 1,0 мл, затем в каждую пробирку добавляют физиологический раствор с таким расчетом, чтобы довести объем разведенного комплемента до 2 мл (табл. 3).

 

Таблица 3

 

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ РАЗВЕДЕНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

ДЛЯ ТИТРОВАНИЯ ЕГО РАБОЧЕЙ ДОЗЫ

 

N пробирки                      

1 

2 

3 

4 

5 

6 

7 

8 

9 

10

Комплемент, разведенный 1:10    

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Физиологический раствор         

1,9

1,8

1,7

1,6

1,5

1,4

1,3

1,2

1,1

1,0

Объем разведенного комплемента  

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

 

Для титрования рабочей дозы комплемента в ряд пробирок наливают по 0,2 мл комплемента различных разведений из пробирок предварительного ряда, а затем к каждому разведению добавляют по 0,4 мл физиологического раствора и 0,4 мл гемолитической системы, выдержанной в термостате 30 минут (табл. 4). После тщательного встряхивания штатив с пробирками ставят в термостат на 30 минут; по истечении этого времени производят учет результатов, как указано выше.

 

Таблица 4

 

ТИТРОВАНИЕ РАБОЧЕЙ ДОЗЫ КОМПЛЕМЕНТА

 

N пробирки              

1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  

8  

9  

10

Комплемент 1:10 в      
разведениях            

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

(из предварительного   
ряда пробирок)         

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Физиологический раствор

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

Гемолитическая система 

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

Оценка результата      

4+ 

3+ 

2+ 

1+ 

-  

-  

-  

-  

-  

- 

 

После выбора рабочей дозы комплемента производят расчет нужного количества его для основного опыта. Например, для опыта, рассчитанного на 100 пробирок, общий объем комплемента в его рабочей дозе составит 0,2 мл х 100 = 20 мл. При рабочей дозе комплемента 0,06 мл на 1 пробирку следует взять на 100 пробирок 0,06 мл х 100, т.е. 6,0 мл комплемента, разведенного 1:10, или 0,6 мл неразведенного. Физиологического раствора на 1 пробирку требуется 0,2 мл - 0,06 мл = 0,14 мл, а на 100 пробирок 0,14 мл х 100, что составляет 14 мл. Таким образом, на опыт в 100 пробирок требуется 6 мл комплемента, разведенного 1:10, и 14 мл физиологического раствора. При расчете на неразведенный комплемент потребуется 0,6 мл его и 19,4 мл физиологического раствора.

При холодном связывании при аналогичных расчетах понадобится 1,2 мл неразведенного комплемента и 18,8 мл физиологического раствора.

 

ПОСТАНОВКА ОСНОВНОГО ОПЫТА

 

Испытуемые сыворотки, инактивированные при 56 °С 30 минут, разводят физиологическим раствором и разливают в пробирки по 0,2 мл. К различным разведениям исследуемых сывороток добавляют по 0,2 мл антигена и 0,2 мл комплемента в его рабочей дозе. После тщательного встряхивания пробирки ставят в термостат на 1 час при 37 °С или в ледник при +4 °С на 16 - 20 часов (1-я фаза реакции).

Каждый опыт должен сопровождаться следующими контролями:

1) контроль всех исследуемых сывороток (0,2 сыворотки в исходном разведении + 0,2 комплемента в рабочей дозе + 0,2 физиологического раствора);

2) контроль антигена (0,2 антигена + 0,2 комплемента в рабочей дозе + 0,2 физиологического раствора);

3) контроль комплемента (0,2 комплемента в рабочей дозе + 0,4 физиологического раствора);

4) контроль гемолитической системы (к 0,6 физиологического раствора добавляют 0,4 гемолитической системы).

Кроме того, необходимо в качестве контроля вводить в опыт заведомо положительную и отрицательную сыворотки с их контролями.

Вторая фаза реакции проводится при 37 °С. В каждую пробирку опыта и контроля добавляют по 0,4 мл гемолитической системы, предварительно выдержанной в термостате в течение 30 минут. Пробирки тщательно встряхивают и ставят в термостат на 20 - 30 минут в зависимости от скорости гемолиза эритроцитов в контролях (табл. 5).

 

Таблица 5

 


 

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ОСНОВНОГО ОПЫТА РСК

 

Ингредиенты

Разведения сывороток           

Конт-
роль
сыво-
ротки

Конт-
роль
анти-
гена

Конт- 
роль  
компле-
мента 

Конт- 
роль  
гемо- 
системы

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

1:3200

1:6400

Сыворотка  

0,2 

0,2 

0,2 

0,2 

0,2  

0,2  

0,2  

0,2 

-   

-     

-     

Антиген    

0,2 

0,2 

0,2 

0,2 

0,2  

0,2  

0,2  

-   

0,2 

-     

-     

Комплемент 

0,2 

0,2 

0,2 

0,2 

0,2  

0,2  

0,2  

0,2 

0,2 

0,2   

-     

Физиологиче-
ский раствор

-   

-   

-   

-   

-    

-    

-    

0,2 

0,2 

0,4   

-     

При 37 °С на час или в холодильник при 4° на 16 - 20 час.                  

Гемолитиче-
ская система

0,4 

0,4 

0,4 

0,4 

0,4  

0,4  

0,4  

0,4 

0,4 

0,4   

0,4   

Физиологиче-
ский раствор

-   

-   

-   

-   

-    

-    

-    

-   

-   

-     

0,6   

В термостат на 30 мин. при 37 °С                               

 


 

В пробирках с заведомо положительной сывороткой и в контроле гемолитической системы должна наблюдаться задержка гемолиза.

Учет результатов рекомендуется проводить спустя 1 час после выдерживания пробирок при комнатной температуре.

Оценка главного опыта заключается, как и при титровании комплемента, в определении степени задержки гемолиза в пробирках с испытуемыми сыворотками по сравнению с соответствующими контролями, в которых возник полный гемолиз.

Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, характеризующееся четырьмя или тремя крестами.

При резко положительных результатах феномен задержки гемолиза сохраняется на протяжении ряда часов.

Результаты реакции считаются достоверными, если в контролях испытуемых сывороток, в контроле антигена и комплемента имеется полный гемолиз, а в контроле гемолитической системы гемолиз отсутствует.

Минимальным диагностическим титром реакции связывания комплемента при сыпном тифе считается разведение сыворотки 1:160 при условии его повышения в динамике заболевания. У сыпнотифозных больных комплементсвязывающие антитела к риккетсиям Провачека в диагностических титрах могут обнаруживаться уже в конце первой недели заболевания, причем при болезни Брилля комплементсвязывающие антитела появляются на несколько более ранних сроках, чем при эпидемическом сыпном тифе. На второй неделе, к 10 - 12 дням болезни положительная РСК обнаруживается почти у всех больных. Титры антител повышаются и достигают максимума к 15 - 20 дням болезни, после чего постепенно снижаются.

Примечание. В результате применения антибиотиков широкого спектра, в особенности на ранних сроках заболевания, может наблюдаться замедление иммуногенеза, выражающееся в более поздней и менее интенсивной выработке комплементсвязывающих антител.

 

Комплементсвязывающие антитела сохраняются у перенесших сыпной тиф в течение весьма продолжительных сроков - на протяжении многих лет и даже десятилетий. Благодаря этому РСК может быть использована для определения "иммунной прослойки" в населении и для проверки анамнестических данных о перенесенном заболевании.

По мере увеличения срока, прошедшего после перенесения сыпного тифа, титры комплементсвязывающих антител снижаются. Однако и низкие титры этой реакции, не достигающие диагностического уровня и не имеющие тенденции к нарастанию, должны рассматриваться как специфические, свидетельствующие об инфицированности обследуемого в прошлом.

 

б) Реакция агглютинации риккетсий (РАР)

 

Реакция агглютинации риккетсий - наиболее простой и доступный серологический метод диагностики сыпного тифа. Для постановки ее применяют корпускулярные антигены, представляющие собой очищенные взвеси риккетсий из яичных культур, из легких зараженных мышей или из инфицированных вшей.

Существует два метода постановки этой реакции: макроскопический и микроскопический.

Макроскопический способ агглютинации риккетсий.

а) Объемный способ. Реакцию ставят в пробирках в объеме 0,4 мл (к различным разведениям сыворотки в объеме 0,2 добавляют равный объем антигена). Каждый опыт обязательно сопровождается контролями исследуемой сыворотки (к 0,2 основного ее разведения добавляют 0,2 физиологического раствора) и антигена (к 0,2 антигена добавляют 0,2 физиологического раствора). Целесообразно в качестве контроля исследовать также заведомо положительную и отрицательную сыворотки. Схема постановки реакции представлена в следующей таблице (табл. 6).

 

Таблица 6

 

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ

АГГЛЮТИНАЦИИ РИККЕТСИЙ (ОБЪЕМНЫЙ СПОСОБ)

 

┌───────────────┬────┬─────┬─────┬─────┬─────┬──────┬─────────────────────┐

│ \Разведения   │1:50│1:100│1:200│1:400│1:800│1:1600│      Контроль      

   \исследуемых│                              ├──────────┬──────────┤

     \сывороток│                              │сыворотки │ антигена │

│Ингре- \                                                        

│диенты   \                                                      

│опыта      \                                                    

├───────────────┼────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────────┼──────────┤

│Исследуемая    │0,2 │0,2  │0,2  │0,2  │0,2  │0,2   │0,2       │-        

│сыворотка                                                       

├───────────────┼────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────────┼──────────┤

│Антиген        │0,2 │0,2  │0,2  │0,2  │0,2  │0,2   │-         │0,2      

├───────────────┼────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────────┼──────────┤

│Физиологический│-   │-    │-    │-    │-    │-     │0,2       │0,2      

│раствор                                                          

└───────────────┴────┴─────┴─────┴─────┴─────┴──────┴──────────┴──────────┘

 

Реакция проводится в условиях термостата при 37° в течение 18 - 20 часов (практически до следующего дня). Результаты ее учитывают спустя 2 часа выдерживания опыта при комнатной температуре. Положительные реакции характеризуются возникновением очень нежного и легко разбиваемого осадка (агглютината) на дне пробирок, видимого невооруженным глазом, поэтому пробирки не следует встряхивать. При чтении реакции с помощью агглютиноскопа изображение агглютината получается несколько увеличенным и особенно отчетливым на черном фоне. При отрицательных результатах содержимое пробирок останется равномерно мутным.

Оценку силы положительных реакций проводят по следующей условной шкале: полное просветление надосадочной жидкости и компактный осадок на дне обозначается тремя крестами (+++); неполное просветление при наличии четко определяемого осадка - двумя крестами (++), незначительное просветление надосадочной жидкости и слабо выраженный осадок оценивается одним крестом (+). При заключении о титре сыворотки принимают в расчет только трех- и двухкрестовые реакции.

Минимальным диагностическим титром при данном способе постановки реакции агглютинации считают разведение сыворотки 1:100 при обязательном условии полного или почти полного склеивания риккетсий, обозначаемого тремя или двумя крестами. В течение заболевания должно иметь место нарастание титра агглютининов при последующих анализах.

б) Капельный способ. Для диагностики сыпного тифа Г.С. Мосинг предложил постановку макроскопической реакции агглютинации в маленьких пробирках объемом 0,8 - 1,0 мл, что позволяет более экономно расходовать риккетсиозный антиген. Разведение исследуемых сывороток производится следующим образом.

В первую пробирку помещают 4 капли физиологического раствора, а во все остальные - по 3 капли. Затем в первую пробирку добавляют одну каплю сыворотки и после смешивания 3 капли переносят во вторую пробирку и т.д. Таким образом получают разведения сыворотки от 1:5 до 1:320. Далее в каждую пробирку добавляют (также каплями) равное количество антигена, представляющего собою суспензию убитых риккетсий Провачека, полученных из кишечников зараженных вшей. В конечном счете сыворотка оказывается разведенной от 1:10 до 1:640.

Контролем исследуемой сыворотки является разведение ее в физиологическом растворе 1:10. Контроль антигена представляет собою смесь трех капель взвеси риккетсий и трех капель физиологического раствора.

Штативы с пробирками встряхивают и помещают в термостат при 36° на 20 - 24 часа. Учет реакции может производиться без агглютиноскопа через 2 - 3 часа после того, как пробирки вынуты из термостата. Положительная реакция характеризуется темно-коричневым осадком с неправильными краями (в виде зонтика) и прозрачной жидкостью над осадком. Характер агглютината мелкозернистый. При отрицательном результате осадок не образуется и жидкость остается мутной. Титр 1:40 является диагностическим.

При повторных заболеваниях сыпным тифом титры реакции агглютинации риккетсий в этой модификации обычно невысоки (в пределах 1:40 - 1:160); в сыворотках лиц, болеющих впервые, агглютинины обнаруживаются в более значительных титрах - порядка 1:80 - 1:640 и выше.

Микроскопический способ, предложенный Вейглем, заключается в том, что различные разведения испытуемой сыворотки наносят петлей в виде маленьких капель на покровное стекло. К каждой капле тонкооттянутой пипеткой добавляют такую же каплю антигена. Края покровного стекла смазывают вазелином и накладывают на предметное стекло с углублением. Препарат помещают на 2 часа в термостат или оставляют до следующего дня при комнатной температуре. Учет реакции производят под микроскопом. Позже был предложен принцип цветной микроагглютинации (Жиру). В СССР он разработан А.В. Пшеничновым и сотр. (1944). Для этой реакции применяют хорошо очищенную взвесь риккетсий Провачека в концентрации 1 млрд. по бактерийному стандарту. Разведения исследуемых сывороток делают в объеме 0,2 мл физиологического раствора. В каждую из пробирок вносят одну каплю антигена. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37° на 2 часа, а затем оставляют до следующего дня в прохладном месте.

Через 18 - 20 часов, после осторожного встряхивания пробирок наносят на предметное стекло тонкой пастеровской пипеткой каплю из каждой пробирки (начиная с последней). После полного высыхания капель мазки фиксируют смесью Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира) и окрашивают по Романовскому-Гимза.

Учет реакции производят с помощью иммерсионной системы микроскопа. При положительной реакции в мазках видны окрашенные в лиловый цвет конгломераты склеенных риккетсий; негативные результаты характеризуются наличием одиночных рассеянных риккетсий.

Реакция считается положительной в разведении сывороток, начиная с 1:160 при трех или двухкрестовой ее интенсивности.

Для использования микроскопического способа требуется применение особо тщательно очищенных взвесей риккетсий, т.к. последние склонны к спонтанному склеиванию, что затрудняет правильный учет результатов.

Микроскопические способы агглютинации были предложены в целях экономии антигена в тот период, когда еще не были освоены широко методы культивирования риккетсий.

Агглютинины нестойки и относительно быстро инактивируются при хранении, поэтому РАР необходимо ставить со свежими сыворотками.

Преимущества ее заключаются в простоте и технической доступности. Недостатком надо считать не всегда выраженную четкость результатов, что не исключает некоторой субъективности в оценке реакции.

Агглютинины к риккетсиям Провачека у лиц, перенесших сыпной тиф, сохраняются лишь в течение ближайшей реконвалесценции и редко обнаруживаются в крови переболевших через 8 - 10 месяцев. Поэтому РАР непригодна для отдаленной ретроспективной диагностики сыпнотифозной инфекции.

 

в) Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

 

Реакция непрямой гемагглютинации основана на способности эритроцитов, на поверхности которых адсорбирован антиген, агглютинироваться специфической иммунной сывороткой.

Для постановки РНГА требуются следующие ингредиенты: антиген, инактивированные сыворотки и эритроциты.

В качестве антигена для РНГА используют эритроциты барана (или человеческие 0 группы крови), на поверхности которых адсорбирован риккетсиозный антиген. Последний готовится из очищенных взвесей риккетсий Провачека, прокипяченных в щелочном растворе. Риккетсиозный антиген титруют с целью определения его рабочей дозы, что указывается в наставлении к выпускаемому препарату.

Испытуемую сыворотку готовят так же, как и для РСК, ее отделяют без эритроцитов от сгустка крови и инактивируют при 56° в течение 30 минут. Так как человеческая сыворотка может содержать гетерогенные гемагглютинины в отношении эритроцитов барана, то она должна быть обязательно истощена бараньими эритроцитами.

Эритроциты барана 2 - 3 раза отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования. Бесцветную надосадочную жидкость удаляют, а осадок используют для РНГА.

 

ПОРЯДОК ПОСТАНОВКИ РНГА

 

Реакцию непрямой гемагглютинации ставят в пробирках или на пластинках с лунками, тщательно вымытых и высушенных.

Накануне постановки реакции проводят: 1. Инактивирование исследуемых сывороток (при 56 °С - 30 минут) и 2. Взятие крови у барана.

В день постановки реакции: 1) отмывают эритроциты барана; 2) адсорбируют антиген на эритроциты барана; 3) извлекают нормальными эритроцитами барана гетерогенные гемагглютинины из исследуемых сывороток.

1. Приготовление адсорбированного на эритроцитах антигена. Сухой антиген перед постановкой реакции растворяют в том объеме физиологического раствора, который указан на этикетке ампулы. Затем 4 мл его переносят пипеткой в центрифужную пробирку и добавляют 0,1 мл отмытых эритроцитов барана. После тщательного смешивания центрифужную пробирку ставят в термостат при 37° на 1 час. Для лучшей адсорбции антигена на поверхности эритроцитов взвесь встряхивают каждые 10 минут. По истечении часа антиген центрифугируют 10 - 15 минут при 2000 - 2500 об./мин. Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку эритроцитов добавляют 10 мл физиологического раствора и тщательно перемешивают. Таким образом получают 1-процентную взвесь эритроцитов с адсорбированным на их поверхности антигеном.

2. Адсорбцию гетерогенных гемагглютининов проводят путем смешивания исследуемых сывороток с отмытым осадком эритроцитов барана в объеме, соответствующем половине объема взятой сыворотки. Например, в центрифужную пробирку наливают 0,9 мл физиологического раствора, 0,1 мл исследуемой инактивированной сыворотки и добавляют 0,05 мл эритроцитов барана. Смесь оставляют при комнатной температуре на 20 минут при периодическом встряхивании. Затем сыворотку центрифугируют, надосадочную жидкость отсасывают в чистую пробирку, а осадок сбрасывают.

Техника постановки реакции заключается в следующем: исследуемые сыворотки (инактивированные и адсорбированные нормальными бараньими эритроцитами) разводят, начиная с 1:250; к каждому разведению сыворотки в объеме 0,4 добавляют 0,1 мл антигена, т.е. 1-процентной взвеси эритроцитов с адсорбированным на их поверхности риккетсиозным антигеном.

Опыт сопровождается следующими контролями:

1. Контроль сыворотки: к 0,4 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:250 добавляют 0,1 мл 1-процентной взвеси нормальных эритроцитов барана.

2. Контроль антигена: к 0,4 мл физиологического раствора добавляют 0,1 мл антигена.

3. Контроль эритроцитов барана: к 0,4 мл физиологического раствора добавляют по 0,1 мл 1-процентной взвеси эритроцитов барана (табл. 7). После тщательного перемешивания ингредиентов опыт выдерживают в термостате при 30° в течение 16 - 20 часов.

 

Таблица 7

 

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РНГА

 

┌──────────────┬─────┬─────┬──────┬──────┬──────┬──────┬───────┬───────┬───────┬─────────────┐

│ \Разведения  │1:250│1:500│1:1000│1:2000│1:4000│1:8000│1:16000│1:32000│1:64000│  Контроль  

   \сыворотки │                                                       ├────┬───┬────┤

     \                                                               │сы- │ан-│эри-│

       \                                                             │во- │ти-│тро-│

         \                                                           │рот-│ге-│ци- │

│Ингредиенты\                                                         │ки  │на │тов

├──────────────┼─────┼─────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼───────┼───────┼────┼───┼────┤

│Исследуемая   │0,4  │0,4  │0,4   │0,4   │0,4   │0,4   │0,4    │0,4    │0,4    │0,4 │-  │-  

│сыворотка                                                                     

├──────────────┼─────┼─────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼───────┼───────┼────┼───┼────┤

│Антиген       │0,1  │0,1  │0,1   │0,1   │0,1   │0,1   │0,1    │0,1    │0,1    │-   │0,1│-  

│(1-процентные │                                                                 

│эритроциты с                                                                   

│адсорбирован- │                                                                 

│ным антигеном)│                                                                 

├──────────────┼─────┼─────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼───────┼───────┼────┼───┼────┤

│Физиологиче-  │-    │-    │-     │-     │-     │-     │-      │-      │-      │-   │0,4│0,4 │

│ский раствор                                                                   

├──────────────┼─────┼─────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼───────┼───────┼────┼───┼────┤

│Эритроциты    │-    │-    │-     │-     │-     │-     │-      │-      │-      │0,1 │-  │0,1 │

└──────────────┴─────┴─────┴──────┴──────┴──────┴──────┴───────┴───────┴───────┴────┴───┴────┘

 

Параллельно с исследуемыми сыворотками необходимо ставить реакцию с контрольной заведомо положительной иммунной сывороткой известного титра.

Учет реакции производят невооруженным глазом. При положительной реакции на дне пробирки образуется широкий, в виде перевернутого зонтика, зернистый осадок из агглютинированных эритроцитов. При встряхивании склеившиеся эритроциты отделяются хлопьями от дна пробирки (или лунки), иногда с трудом. При отрицательной реакции эритроциты оседают в центре дна пробирки в форме ровного маленького диска с гладкими краями. При встряхивании пробирки эритроциты поднимаются со дна и образуют равномерную муть.

Показания реакции считаются достоверными при условии отрицательных результатов в контрольных и при положительной реакции до титра с заведомо иммунной сывороткой.

Диагностическим считают титр реакции 1:1000. Гемагглютинины в убедительных титрах могут быть обнаружены в остром периоде болезни; они относительно быстро исчезают из крови после перенесенного заболевания (от 2 - 3 до 6 месяцев). В связи с этим р. гемагглютинации рекомендуют использовать в сочетании с РСК для дифференциации свежих случаев сыпного тифа от ранее перенесенных заболеваний.

 

г) Реакция преципитации

 

Преципитиноген (растворимый антиген) получают путем обработки этиловым эфиром хорошо очищенной взвеси риккетсий. Препарат представляет собой термолябильное вещество белковой природы, обладающее выраженными антигенными и иммуногенными свойствами.

Реакция преципитации антигена риккетсий Провачека описана в следующих трех модификациях.

1. По типу флокуляции (Шепард и Топпинг, 1945). Она проводится следующим образом: в ряд пробирок наливают по 0,2 мл различных разведений сыворотки и по 0,2 мл преципитиногена. После их смешивания пробирки ставят в водяную баню или в термостат при 37°. О результатах судят через 16 - 18 часов по наличию преципитата в пробирках.

2. Реакция кольцепреципитации. Испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором, начиная с 1:8. На 0,2 мл каждого разведения исследуемой сыворотки осторожно наслаивают в узких пробирках по 0,2 мл преципитиногена. В положительных случаях при комнатной температуре в течение 10 минут на границе обеих жидкостей возникает беловатое кольцо помутнения, особенно отчетливо различимое на темном фоне.

Опыт должен сопровождаться контролями исследуемых сывороток, антигена, заведомо положительной и отрицательной сывороток.

Обязательным условием при постановке данной реакции является прозрачность сыворотки и преципитиногена. Реакция кольцепреципитации была с успехом испытана для диагностики сыпного тифа, а также в целях сравнительного распознавания сыпного тифа и крысиного риккетсиоза (Р.Д. Зайцева, 1952).

Минимальным диагностическим титром этой серологической пробы считают разведение сыворотки 1:16 при условии нарастания концентрации преципитинов при последующих анализах. При сыпном тифе в течение болезни наиболее часто регистрируются титры порядка 1:32 - 1:128. К периоду выздоровления отмечаются наиболее высокие показатели в пределах разведения сыворотки 1:256 - 1:512.

Длительность сохранения преципитинов в крови у перенесших сыпной тиф совпадает примерно со сроками обнаружения агглютининов.

3. Реакция преципитации в агаровом геле по методу Оухтерлони (1948) в микромодификации по Грассе (1958). В этой реакции использован принцип двойной диффузии в агаровом геле, сущность которого состоит в том, что свободно диффундирующие в агаре растворенный антиген и соответствующая ему иммунная сыворотка образуют хорошо видимый невооруженным глазом преципитат.

Реакция эта может быть использована как ориентировочная проба для серодиагностики сыпного тифа в остром периоде болезни.

 

д) Реакция нейтрализации токсического вещества риккетсий

 

Сущность этого метода состоит в способности специфических иммунных сывороток нейтрализовать токсическое вещество риккетсий. Последнее тесно связано с микробными клетками; оно нестойко и быстро разрушается не только при нагревании, но и при комнатной температуре. Поэтому постановка реакции нейтрализации требует применения свежеприготовленных взвесей живых риккетсий Провачека.

Основному опыту предшествует определение (титрование) летальной дозы испытуемой взвеси риккетсий. Для этого готовят различные разведения взвеси в физиологическом растворе с фосфатным буфером (pH = 7,4 - 7,6). Каждое из разведений (1:4, 1:8, 1:16 и т.д.) вводят в объеме 0,5 мл в хвостовую вену двум или большему числу белых мышей весом 12 - 15 граммов. Подопытные животные погибают от интоксикации на протяжении суток. Летальной дозой считают то наибольшее разведение риккетсий, которое вызывает гибель всех взятых в опыт мышей.

Для испытания нейтрализующей способности сывороток и определения ее антитоксического титра применяют двойную смертельную дозу токсического вещества риккетсий. Ее добавляют к равному объему различных разведений исследуемых сывороток. Смесь встряхивают и выдерживают в течение часа при 37° или на протяжении двух часов при комнатной температуре. После этого содержимое каждой пробирки вводят по 0,5 мл в хвостовую вену белым мышам. Контрольным животным вводят нормальную человеческую сыворотку в разведении 1:10, смешанную со взятой в опыт дозой токсического вещества. Антитоксическим титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, предотвращающее гибель подопытных животных. Антитела, нейтрализующие токсическое вещество риккетсий, начинают обнаруживаться в сыворотках с 4 - 5 дня заболевания. За минимальный диагностический титр принимают разведение сывороток 1:80 - 1:160 при непременном условии нарастания концентрации антител на более поздних сроках заболевания. В остром периоде болезни вируснейтрализующие антитела повышаются синхронно с комплементсвязывающими. Титры нередко достигают более высоких показателей, чем РСК, - порядка - 1:4000 - 1:16000 и выше. После перенесенного сыпного тифа нейтрализующие антитела в низких титрах сохраняются в крови в течение более продолжительных сроков, чем комплементсвязывающие. Реакция нейтрализации токсического вещества риккетсий является строго специфичной и высокочувствительной серологической пробой.

 

е) Иммунфлуоресцентный метод

 

Метод флуоресцирующих антител сочетает в себе принципы серологического и люминесцентного исследования.

Флуоресцирующие антитела представляют собой иммунные сыворотки или их глобулиновые фракции, соединенные с люминесцирующими красителями - флуорохромами, способными светиться при воздействии ультрафиолетовых или фиолетово-синих лучей. В качестве красителей чаще применяют изотиоцианат флуоресцеина. Характерным свойством флуоресцирующих антител является их способность вступать в специфическую связь с гомологичными антигенами, что позволяет быстро выявлять антигены и антитела. При этом флуоресцирующие антитела становятся для искомого антигена своего рода иммунохимическими индикаторами, так как образующийся специфический комплекс "антиген - антитело" приобретает способность светиться.

В настоящее время применяют следующие два способа:

Прямой или одноступенчатый, основанный на учете непосредственного взаимодействия флуоресцирующих антител с искомым антигеном (рис. 2А).

Метод специфичен и высокочувствителен. Однако необходимость приготовления флуоресцирующих конъюгатов против всех искомых антигенов несколько ограничивает его диагностическое применение.

Второй способ получил название непрямого или двухступенчатого (рис. 2Б). Предложены две его модификации: обнаружение антигена при помощи флуоресцирующего антиглобулина (Уеллер-Кунс) и обнаружение антигена путем флуоресцентной "окраски комплемента".

В первом случае (рис. 2Б, 1) на антиген сначала наслаивают иммунную, но нефлуоресцирующую сыворотку, а затем флуоресцирующую антисыворотку. Создается таким образом тройной комплекс: антиген + специфический глобулин + флуоресцирующий антиглобулин. Основное преимущество данного способа состоит в том, что отпадает необходимость готовить флуоресцирующие конъюгаты для каждого антигена, а достаточно иметь один-два препарата флуоресцирующих антител против глобулинов животных разных видов.

Так как большинство специфических комплексов (антиген + антитело) способны связывать комплемент, Голдвассер и Шепард (1958) предложили второй вариант непрямого метода (рис. 2Б, 2). Согласно этой модификации к специфической нефлуоресцирующей сыворотке, наслаиваемой на антиген, добавляют комплемент нормальной морской свинки, а затем образующееся соединение антигена и антитела с комплементом обрабатывают (окрашивают) флуоресцирующим глобулином против сыворотки морской свинки. Таким образом, этот метод выявляет комплекс антиген + антитело + комплемент морской свинки + флуоресцирующий глобулиновый конъюгат против сыворотки морской свинки. Последний по существу является индикатором, подобным гемолитической системе в реакции связывания комплемента.

Основное преимущество этого метода - его универсальность, так как для выявления различных антигенов необходим лишь один флуоресцирующий конъюгат - против глобулинов морской свинки.

 

МЕТОДИКА РАБОТЫ С ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИМИ АНТИТЕЛАМИ

 

Для приготовления мазков берут чистые обезжиренные предметные стекла, на которые тонким слоем наносят исследуемые взвеси (при прямом способе окраски) или заведомо известные взвеси антигена (при непрямом методе исследования, имеющем целью обнаружение антител); мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре, затем фиксируют путем погружения их в этиловый спирт или ацетон на 10 - 15 минут. После фиксации место нанесения мазка обводят восковым карандашом.

Техника окраски мазков определяется методом применения флуоресцирующих антител (см. рис. 2).

При прямом методе на фиксированный и высушенный мазок наносят каплю разведенного конъюгата. (Разведение делают в соответствии с указанием на этикетке ампулы.) Обработку проводят при комнатной температуре или при 37° во влажной камере (чашки Петри с увлажненным дном), предупреждающей высыхание конъюгата. Обычно обработка продолжается от 15 до 30 минут. Длительность окрашивания, как и "рабочее разведение" сыворотки, следует устанавливать опытным путем для каждой новой серии флуоресцирующего конъюгата.

Отмывание мазков от избытка флуоресцирующей сыворотки производят погружением их в фосфатно-буферный раствор (pH 7,2 - 7,4) в течение 10 мин. После споласкивания дистиллированной водой препараты высушивают на воздухе и исследуют.

При непрямом методе препарат сначала обрабатывают специфической нефлуоресцирующей сывороткой какого-либо животного (кролик, баран, лошадь и т.д.). Как правило, используют сыворотки, разведенные в 10 и более раз. На 3 - 10 минут препарат помещают во влажной камере в термостат, а затем тщательно промывают в сменяемой водопроводной воде или в физиологическом растворе.

На втором этапе слегка подсушенный мазок окрашивают в течение 10 - 20 минут флуоресцирующим антиглобулином (соответственно - антикроличьим, антибараньим, противолошадиным и т.д.). Эту обработку также осуществляют во влажной камере при температуре 37°. Дальнейшее промывание и высушивание мазков проводят, как и при прямом методе.

При использовании непрямого метода с окраской комплемента на мазок наносят смесь, состоящую из равных объемов нефлуоресцирующей диагностической сыворотки и комплемента морской свинки, разведенного 1:10. Обработку этой смесью проводят в течение 30 минут во влажной камере при температуре 37°. Затем препарат 10 минут промывают в фосфатном буферном растворе, ополаскивают и просушивают. Второй этап обработки заключается в окраске мазков флуоресцирующей сывороткой против глобулинов морской свинки.

Продолжительность обработки во влажной камере 30 минут. Последующее промывание и исследование препаратов проводится, как и при прямом методе.

Окрашенные препараты исследуют при помощи люминесцентного микроскопа (МЛ-2 или МЛ-3). При микроскопировании пользуются окуляром 7х или 10х и иммерсионными объективами - ахроматами 90х - 100х, применяя нефлуоресцирующее масло или химически чистый диметилфталат.

 

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ

ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ СЫПНОГО ТИФА

 

Флуоресцирующие конъюгаты могут быть использованы для быстрого определения специфических сыпнотифозных антител в крови больных. В основе этого способа лежит применение непрямого (двуступенчатого) метода.

Для серодиагностики мазки готовят из сухих корпускулярных антигенов, выпускаемых для реакции агглютинации, риккетсий Провачека.

Ампулу сухого антигена растворяют в 2 - 3 раза большем объеме физиологического раствора, чем для реакции агглютинации. На каждое предметное стекло наносят одновременно по 7 - 8 капель (мазков), высушивают их на воздухе, после чего фиксируют. Из исследуемых сывороток больных готовят разведения от 1:100 до 1:1600, которыми затем обрабатывают приготовленные мазки из риккетсий Провачека. На втором этапе (после промывания мазков) производят окрашивание их флуоресцирующими глобулинами против сыворотки человека. В качестве контроля может применяться обработка мазков риккетсий Провачека нормальной (неиммунной) сывороткой. Флуоресценция риккетсий Провачека наблюдается лишь при взаимодействии с сыворотками, содержащими специфические антитела.

Диагностические титры сывороток, исследуемых непрямым методом флуоресцирующих антител, те же, что и при РСК.

 

ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНФЛУОРЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА

ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ИНФИЦИРОВАННЫХ ПЕРЕНОСЧИКОВ

 

До введения в практику иммунлюминесцентного способа определение зараженности вшей риккетсиями осуществлялось путем биологической пробы на морских свинках, причем решение вопроса об инфицированности паразитов затягивалось на недели. Ныне, используя прямой метод флуоресцирующих антител в качестве сигнального, заключение может быть дано в течение двух-трех часов.

Из кишечников насекомых, снятых с больного или окружающих его лиц, делают мазки, которые после фиксации препаратов окрашивают флуоресцирующей специфической сывороткой против риккетсий Провачека и исследуют затем с помощью люминесцентного микроскопа. В положительных случаях наблюдается яркое свечение как отдельных клеток возбудителя, так и его скоплений.

Для контроля специфичности свечения применяют окраску параллельного мазка гетерологичной люминесцентной сывороткой, а также окраску мазка из корпускулярного антигена риккетсий Провачека специфическим конъюгатом.

 

2. РЕАКЦИЯ ВЕЙЛЬ-ФЕЛИКСА

 

До относительно недавнего времени эта серологическая проба была единственным широко доступным методом подтверждения сыпного тифа.

Сущность реакции Вейль-Феликса заключается в способности сывороток сыпнотифозных больных агглютинировать культуры В. протея OX-19 или приготовленные из них диагностикумы, что объясняется общностью термостабильного антигена у этих микроорганизмов и у риккетсий Провачека.

Реакция Вейль-Феликса, предложенная еще в двадцатых годах, полностью оправдала себя в период эпидемического распространения сытного тифа. В крови этих больных уже в конце первой недели болезни обнаруживались антитела к протею OX-19, титр которых повышался на второй-третьей неделе, достигая весьма высоких показателей (до 1:640 - 1:2560 и выше).

Антигеном при постановке реакции Вейль-Феликса является живая культура или диагностикум из гладких (0) колоний X-протея. Наилучшая концентрация антигена - 500 миллионов микробных тел. Техника постановки реакции Вейль-Феликса в пробирках с различными разведениями сывороток ничем существенно не отличается от классической реакции Видаля.

Минимальным диагностическим титром реакции при сыпном тифе следует считать разведение сыворотки 1:200 при условии полного склеивания микробной взвеси и нарастания титра в течение болезни.

При болезни Брилля реакция Вейль-Феликса потеряла свое диагностическое значение. При этой форме сыпнотифозной инфекции она нередко запаздывает, дает невысокие титры без их нарастания, а в значительном проценте случаев (30 - 40% и чаще) оказывается отрицательной на всем протяжении болезни и выздоровления. Таким образом, негативные результаты р. Вейль-Феликса еще не дают основания исключать сыпнотифозную этиологию лихорадочных заболеваний. Упомянутое своеобразие р. Вейль-Феликса не связано с утратой культурами протея X-19 агглютинабильности, а зависит от иммунобиологических особенностей организма больных при повторном сыпном тифе (болезни Брилля).

Отрицательные и слабо выраженные реакции агглютинации с протеем OX-19 при положительных серологических реакциях со специфическими антигенами из риккетсий Провачека послужили основанием рекомендовать реакцию Вейль-Феликса в качестве вспомогательной пробы для серодиагностики болезни Брилля и ее дифференциации от эпидемического сыпного тифа. Однако, учитывая, что примерно у четверти больных болезнью Брилля (при среднетяжелых и тяжелых формах ее) реакция с протеем может давать положительные результаты в диагностических титрах, этот метод дифференциации не может считаться достаточно достоверным.

 

3. ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЕ ЭПИДЕМИЧЕСКОГО СЫПНОГО ТИФА

И БОЛЕЗНИ БРИЛЛЯ ПО КЛАССАМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

 

До недавнего времени основным критерием сравнительного распознавания эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля являлись данные анамнеза. Успехи иммунологии в области изучения структуры антител открыли возможность применения объективных методов дифференциации этих форм сыпного тифа, основанных на разграничении антител по классам иммунных глобулинов.

Было выяснено, что большая часть антител к микробным и вирусным агентам относится к иммуноглобулинам двух типов: JgG (7S), и JgM (19S). При этом условлено, что при первичном заражении человека или животного в их организме сначала вырабатываются 19S антитела (макроглобулины), которые затем заменяются антителами 7S. При повторном инфицировании тем же патогенным агентом вырабатываются 7S антитела.

Муррей и сотр. (1965) показали возможность сравнительного распознавания повторного сыпного тифа (болезни Брилля) и первичного (эпидемического) при помощи исследования структуры антител. Для этой цели был применен способ, основанный на избирательном разрушении макроглобулинов (19S антител) редуцирующими веществами, содержащими активные сульфгидрильные группы. Так, при обработке ранних сывороток 2-меркаптэтанолом возникает резкое снижение титров агглютининов в сыворотках больных эпидемическим сыпным тифом, что позволяет отнести эти антитела к 19S глобулинам. При болезни Брилля препарат не оказывает разрушающего действия на антитела, и титры их остаются стабильными. Аналогичные результаты получают при воздействии на ранние антитела этантиолом.

Исследования, проведенные в Ленинграде (Ф.И. Красник, 1966, 1970), показали, что разграничение антител при помощи этантиола в РСК дает четкие результаты, позволяющие надежно дифференцировать болезнь Брилля от эпидемического сыпного тифа. С этой целью исследуемые сыворотки, разведенные 1:10 в свежеприготовленном физиологическом растворе (или в вероналовом буфере), смешивают с равным объемом этантиола (в конечном разведении последнего 0,06 М); пробирки со смесью тщательно закрывают резиновыми пробками. Контрольные порции сывороток (без этантиола) смешивают с физиологическим раствором. Смеси выдерживают при комнатной температуре 18 - 20 часов, после чего их прогревают при 56 °С 30 минут в вытяжном шкафу, т.к. этантиол обладает большой летучестью и крайне неприятным запахом.

Фиксацию комплемента проводят в течение часа при 37°. РСК ставят с 8 единицами антигена и с двумя единицами комплемента. Заключение дают на основании сопоставления высоты титров антител в сыворотках, обработанных и не обработанных этантиолом.

Дифференциацию антител можно проводить также при помощи других редуцирующих реактивов, например цистеина, меркамина. По данным З.А. Вороновой (1968), сыпнотифозные антитела могут быть разграничены по классам иммуноглобулинов в РНГА при воздействии цистеина.

Самым простым и доступным способом дифференцирования антител при сыпнотифозной инфекции надо считать применение различных температур при инактивации сывороток. Этот метод основан на различной термолябильности иммуноглобулинов. Макроглобулины (19S) термолябильны и при прогревании сывороток при 60 °С разрушаются, что приводит к снижению титров комплементсвязывающих антител по сравнению с теми же сыворотками, прогретыми при 56 °С. Сыворотки, содержащие 7S антитела, более устойчивы к нагреванию до 60 °С; титры их при этом остаются прежними или снижаются лишь на одно разведение.

Примечания: 1) как при воздействии редуцирующих агентов, так и при инактивации при различных температурах выявление наличия 19S антител возможно лишь в сыворотках, взятых до 10 - 12 дня болезни; 2) при оценке результатов реакций двукратное снижение титров исследуемых сывороток по сравнению с контрольными не считается доказательным. В расчет принимают лишь 4- и 8-кратное и большее их снижение.

 

Наличие термолябильных 19S антител в сыворотках больных эпидемическим сыпным тифом должно быть принято во внимание при повседневной лабораторной диагностике сыпного тифа при помощи РСК, так как несоблюдение температурного режима инактивации сывороток (перегрев их до 60°) может привести к негативным результатам реакции вследствие теплового разрушения антител.

Кроме приведенных способов дифференциации, было установлено, что антитела у различных категорий больных обладают различной активностью в отношении антигенов, что объясняется различной их авидностью. Так, комплементсвязывающие антитела у больных эпидемическим сыпным тифом выявляются лишь с антигенами высокой концентрации (8 единиц); при болезни Брилля антитела могут быть обнаружены и при минимальной концентрации антигена (1 единица).

Для дифференцирования эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля применяют также параллельную постановку р. агглютинации или РСК с антигенами из риккетсий Провачека и риккетсий Музера. При эпидемическом сыпном тифе наблюдается значительное отставание титра с гетерологичным антигеном в динамике заболевания. При болезни Брилля титры реакции с обоими антигенами оказываются довольно близкими. Данный способ может быть применен только при условии хорошо очищенных и оттитрованных антигенов.

Наиболее надежное дифференцирование эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля обеспечивает сочетанное применение двух-трех методик из числа вышеупомянутых.

 

 






Яндекс цитирования

© www.ussrdoc.com, 2011.