Полное собрание законодательства СССР
Система доступа к базе всех нормативно-правовых актов Союза Советских Социалистицеских Республик.
www.ussrdoc.com

 





Сборники документов по хронологии с 1917г по 1992г
| Сборник 1 | Сборник 2 | Сборник 3 | Сборник 4 | Сборник 5 | Сборник 6 | Сборник 7 | Сборник 8 | Сборник 9 | Сборник 10 |



 

Утверждены

Минздравом СССР

12 мая 1983 г. N 2799-83

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПРЕПАРАТА ВИРИН-ДИПРИОН

НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

 

    Характеристика  препарата.  Вирусный  препарат   вирин-диприон

предназначен  для  борьбы  с личинками рыжего соснового пилильщика

(РСП)  I  -  III  возрастов.  Действующее начало препарата - вирус

ядерного   полиэдроза   (ВЯП)   кишечного   типа,  содержащийся  в

тельцах-включениях (полиэдрах). Препарат жидкой формы представляет

собой   концентрат-суспензию   полиэдров   темно-серого   цвета  с

беловатым   осадком  при  отстое,  состоящим  главным  образом  из

полиэдров.  Размер  полиэдров  колеблется от 0,5 до 4 мк, титр 1 x

  10

10   пдр/мл.   Применяется   путем   наземного   или  авиационного

опрыскивания сосновых насаждений, пораженных вредителями.

Принцип метода. ИФ-метод выявления остаточных количеств вирусного препарата основан на явлении иммунофлюоресценции, широко используемом в медицинской вирусологии для идентификации микроорганизмов. В основе метода лежит специфическая реакция взаимодействия антигена (в данном случае полиэдров ВЯП рыжего соснового пилильщика) с антителами, меченными флюоресцирующим красителем ФИТЦ. Реакция выявляется при наблюдении в люминесцентном микроскопе в виде специфического свечения комплекса антиген - антитело (яркое желто-зеленое свечение полиэдров).

    Метрологическая  характеристика  метода. Данным методом  можно

                    2

определить от 1 x 10  и более полиэдров в 1 мл субстрата.

Избирательность метода. При условии применения качественных гипериммунных антиполиэдренных сывороток и устранения неспецифического свечения в исследуемых препаратах метод расценивается как специфический и высокочувствительный. При условии централизованного изготовления специфической антисыворотки ИФ-метод является экспрессным.

    Отбор проб. Если проба состоит из мелких растительных объектов

(хвоя,  трава, листья, ягоды), из них готовят навеску 200 - 300 г,

помещают   в   широкогорлые   банки,   доливают   200   -  300  мл

физиологического раствора с pH 7,4 - 7,6, энергично встряхивают 10

-  15  мин.,  отстаивают  10  мин.,  надосадок  центрифугируют при

                                 -1

скорости  вращения  5  тыс.  мин.  ,  осадок ресуспендируют в 1 мл

дистиллированной  воды.  Для  дальнейшей  работы  суспензию  можно

хранить при температуре 4 °C до 3 сут.

Реактивы и материалы, приборы и посуда. Люминесцирующая ослиная сыворотка против глобулинов кролика, изготовленная Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. Иммунная специфическая кроличья сыворотка против полиэдров ВЯП РСП. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат. Дистиллированная вода. Физиологический раствор (0,15 М NaCl) с pH 7,4 - 7,6. Ацетон. Мертиолат натрия или борная кислота. Синька Эванса. Антибиотики - пенициллин, стрептомицин, 5-нитрооксихинолин. Люминесцентный микроскоп марки МЛ-2 или МЛ-3. Центрифуга ПЛС-1 и др. Пипетки градуированные на 1 и 5 мл. Чашки Петри. Предметные стекла.

Подготовка к определению. Основные реагенты в данном определении - иммунная сыворотка против ядерного полиэдроза рыжего соснового пилильщика, являющегося действующим началом препарата вирусного инсектицида вирин-диприон, а также меченная ФИТЦ сыворотка против глобулинов кролика. Последняя сыворотка изготовляется в Институте им. Н.Ф. Гамалеи. Что касается иммунной сыворотки, то для проведения анализа рекомендуется самостоятельно изготовить антисыворотку к полиэдрам из препарата вирин-диприон по следующей схеме.

Полиэдры для иммунизации животных извлекают непосредственно из препарата вирин-диприон, можно получать их из больных гусениц соответствующего вида. Очистку и концентрацию полиэдров ведут методами дифференциального центрифугирования и в градиенте плотности сахарозы.

    Взвесь полиэдров за сутки до  введения  животным  обрабатывают

антибиотиками   из   расчета   500  -  1000  ед.  стрептомицина  и

пенициллина  и  20  мкг/мл 5-нитрооксихинолина. Перед иммунизацией

взвесь стерильно отмывают от антибиотиков, полиэдры ресуспендируют

в  стерильном  физиологическом  растворе.  Титр  инокулята  обычно

                   9

составлял  1  x  10  пдр/мл. Приготовленным антигеном иммунизируют

беспородных  кроликов  массой  по  2,5  - 3 кг по следующей схеме.

Инъекции проводят внутривенно трижды с недельным интервалом по 1,5

- 2,0 - 2,5 мл, реиммунизацию - через 4 недели внутривенно 2,5 мл.

Кровь  берут через 10 дней после реиммунизации. Сыворотку хранят с

добавлением  консерванта  (мертиолат  1:10000)  при  -20 °C. Лучше

сыворотку  лиофилизировать  и  хранить  при  4 °C. В этих условиях

высушенная сыворотка сохраняет активность до 5 лет.

Ход анализа. Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 кв. см. Затем на стекло микропипеткой наносят 0,02 мл исследуемой суспензии, равномерно распределяя ее по отмеченной площади. Препарат подсушивают на воздухе, для фиксации опускают в ацетон на 15 мин., после чего окрашивают синькой Эванса для гашения неспецифического свечения. Используют синьку Эванса в разведении 1:10000 дистиллированной водой. Время обработки препарата синькой 10 мин., затем его промывают проточной водой и подсушивают, после чего он должен иметь слабо-голубую окраску. Затем на препарат наносят антиполиэдренную иммунную сыворотку против ВЯП РСП, предварительно разведенную 1:10 физиологическим раствором, помещают на 20 мин. при 37 °C во влажную камеру, затем смывают проточной водой, подсушивают на воздухе, после чего наносят ослиную меченную ФИТЦ сыворотку против глобулинов кролика в рабочем разведении, указанном на ампуле. Выдерживают 20 мин. в термостате при 37 °C во влажной камере с последующим промыванием в проточной воде. Подсушенный препарат готов к просмотру в люминесцентный микроскоп. Препарат просматривают под иммерсией, используя нефлюоресцирующее иммерсионное масло, объектив 90, окуляр 8x. Полиэдры в препарате выявляются по специфическому свечению ярко-желто-зеленого ободка на общем красном фоне.

Контроль: а) препараты, приготовленные по той же схеме, но без обработки специфической иммунной сывороткой; б) препараты, обработанные обеими сыворотками, но заведомо не содержащие выявленных полиэдров. В контрольных препаратах свечения полиэдров не выявляется.

Обработка результатов анализа. Число полиэдров в 1 мл исследуемой суспензии (концентрат смыва со 100 кв. см поверхности или 200 - 300 г навески) M вычисляют по формуле:

 

                                 aS

                             M = ---,

                                 VS

                                   1

 

    где:

    a - среднее число полиэдров в одном квадрате окулярной сетки;

    S - площадь исследуемого мазка, кв. мм;

    V - объем нанесенной на стекло суспензии, мл;

    S  - площадь квадрата окулярной сетки, кв. мм.

     1

Полиэдры подсчитывают в 100 и более квадратах окулярной сетки.

Пример. Для анализа взяли навеску хвои 200 г с обработанного препаратом дерева, поместили в колбу. Добавили 200 мл подщелоченного физиологического раствора. Встряхивали 15 мин. Затем профильтровали, отцентрифугировали, ресуспендировали осадок в 1 мл дистиллированной воды. Из суспензии приготовили мазок на предметном стекле, как описано выше. При просмотре препарата в люминесцентном микроскопе подсчитали общее число полиэдров в 150 квадратах окулярной сетки:

 

            SUM    = 320, отсюда a = 320 : 150 = 2,13.

               150

 

    Площадь  мазка  известна:  S  =  20 мм x 20 мм  =  400 кв. мм.

Сторона квадрата  окулярной  сетки  равна  0,0062 мм (определили с

помощью объект-микрометра), т.е. площадь квадрата  окулярной сетки

             2

S  = (0,0062)  = 0,00004 кв. мм.

 1

    Объем нанесенной на стекло суспензии V = 0,02 мл.

                                                                9

    Таким образом, M = (2,13 x 400) / (0,02 x 0,0004) = 1,1 x 10 ,

                                                                 9

т.е.  на 100 кв. см  обследованной  площади  приходится  1,1 x 10

                                         7

полиэдров, на 1 кв. см площади - 1,1 x 10 .

Требования безопасности. Соблюдаются меры безопасности, обычно рекомендуемые для работы с микроорганизмами IV группы.

 

 






Яндекс цитирования

© www.ussrdoc.com, 2011.